熒光原位雜交（FISH)的實驗步驟

  熒光原位雜交（FISH）的基本原理是，按照兩個核酸的堿基序列互 補(bǔ)原則，用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記 DNA 探針，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或 DNA 纖維切片上，再與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子特異性結(jié)合，經(jīng)熒光檢測系統(tǒng)和圖形分析技術(shù)對染色體或 DNA 纖維上的 DNA 序列定位、定性和相對定量。實驗方法如下：
 
1）玻片處理
 
（a）玻片清洗：熱肥皂水刷洗，1% 鹽酸浸泡 24 h，再在 0.1% 焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡 24 h。
（b）硅化處理：玻片和蓋玻片 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽酸煮沸 10 min，烘干，錫紙包好 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?br> （c）明膠涂片制備：將烘干的玻片放入明膠中 10 min，然后 60 ℃ 烘干過夜備用。
（d）試劑瓶、塑料器皿及組織勻漿器的處理試劑瓶、組織勻漿器先清洗干凈，用 1 mL/LDEPC（Diethyl Pyrocarbonate）水溶液浸泡處理（37 ℃、2 h，室溫過夜），高壓消毒去除 DEPC，然后 250 ℃ 烘干 4 h 以上或 200 ℃ 過夜。稱量試劑勺也要干烤。塑料器皿最好用滅菌的一次性塑料用品，使用前進(jìn)行高壓消毒。為保證質(zhì)量，凡使用的槍頭、試管等均經(jīng) 0. 5 mL/L DEPC 水溶液處理 3 h 以上，然后再高壓滅菌，烘干。若為進(jìn)口已處理的無 RNase 和 DNase 的槍頭、試管可不必處理直接使用。
 
參照圖
 
 
2）樣品制備及其所涉及的試劑包括：
 
（a）緩沖溶液：
1 × PBS 緩沖溶液：NaCl 8 g，Na2 HPO4 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，溶入 1000 mL 超純水；
3 × PBS 緩沖溶液：NaCl 24 g，Na2 HPO4 8.7 g，KCl 0.6 g，KH2PO4 0.6 g，溶入 1000 mL 超純水；
通常配制成 10 × PBS 的儲備液，3 × PBS 和 1 × PBS 可用 DEPC 水稀釋獲得。
 
（b）4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
稱取 2 g PFA 加入 30 ml 約 60 ℃ 的熱水，滴幾滴 20% NaOH 放在磁力攪拌器攪拌至完全溶解。然后向其中加入 16.5 ml 3 × PBS 緩沖液，在冰浴中充分混勻冷卻，冷卻后，用 HCl 調(diào)整至中性（7.2 左右），拿出攪拌子。向 PFA 溶液中加入超純水，定容在 50 ml。用 0.45 微米的膜過濾后使用。（室溫或 4 ℃ 保存?zhèn)溆茫?br>  
（c）配制 50%，80%，98% 無水乙醇溶液，每個總量 20 mL。
 
（d）DAPI 溶液
用 1 ml ddH2O 將 DAPI 溶解，制得 2.9 mM 的 DAPI 溶液（1 mg DAPI/1 mL H2O）。（DAPI 不能直接用 PBS 等緩沖液溶解，需要先用水將其溶解）。取適量 DAPI 水溶液加到 PBS 中，制備成 10～50 μM 的 DAPI 溶液。
 
（e）各種溶液的配制：凡是水溶性液體均用 1 mL/L DEPC 水配制。
 
注意：
 
    配制時應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因 PFA 有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；
    加熱時，溫度不宜過高，常為 60~65 ℃，否則，PFA 降解失效；
    配制好的 PFA 雖可存放一定時間，但過久的液體，固定效果下降，應(yīng)盡早使用。
    4% PFA 是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的 RNA，同時對形態(tài)保持也較好。樣品固定時間在 2～3 小時，RNA 含量較為恒定。過度延長固定時間會引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。
 
 
3）取樣及保存方法
 
（a）反應(yīng)器沉淀前取樣 2～5 mL 至離心管。
（b）離心 （2000 r/min）5 min，去上清液 （加蒸餾水重復(fù)兩次）。
（c）樣品加入 1 mL 多聚甲醛，搖勻，4 ℃ 下放置 3 h。
（d）樣品離心（12000r/min）5 min，去上清夜。
（e）加入 1 × PBS，搖勻，離心（10000r/min）5 min，去上清夜 （重復(fù) 3 次）。
（f）加 0.5 mL 1 × PBS，0.5 mL 無水乙醇，搖勻，-20 ℃ 保存 （可保存 6 個月）。
 
4）樣品固定：
 
稀釋樣品 3～5 倍，對樣品進(jìn)行超聲處理 （3W 超聲 2～3 min，沉降 1 min，去沉淀物，5W 超聲 5 min），將活性污泥絮體打散成單個細(xì)胞以便于顯微鏡 計數(shù)。然后取 3 μL 樣品涂于包埋明膠的玻片上 （檢查樣片本底），37 ℃ 的熱烘箱固定 2 h（或者在空氣中干燥 2 h 或者過夜）。依次用 50%、80%、98% （質(zhì)量比）乙醇浸漬 3 min，對細(xì)胞進(jìn)行脫水后，立放，并進(jìn)行干燥。
 
5）樣品雜交
 
實驗所涉及的緩沖液包括雜交緩沖液 （Hybridization Buffer, HB）和淋洗緩沖液 （Washing Buffer, WB），其組分如表 1-1 和表 1-2。
 
表 1-1 雜交緩沖液（Hybridization Buffer）
             5%           10%         20%         30%         35%         40% 
0.05%SDS（μL）           1.2          1.2          1.2          1.2          1.2          1.2  
50mMTri-HCl（μL）           24           24           24           24           24           24   
5mol NaCl（mL）        4.32        4.32        4.32        4.32        4.32        4.32
甲酰胺（mL）             1.2          2.4          4.8          7.2          8.4          9.6  
蒸餾水（mL）             18.4548          17.2548          14.8548          12.4548          11.2548          10.0548  
探針              Nsm156         Ntcoc206              Ntspn693              Nsv443          Ntspa662 NSO1225 Nmv           NIT3      
 
表 1-2 淋洗緩沖液（Washing Buffer）
組分              體積      
0.05%SDS              0.6μL     
50m MTri-HCl              12μL      
5mol NaCl            2.16mL  
蒸餾水           42.8274mL    
 
（a）吸取 2 mL 雜交緩沖液遍布在雜交盒內(nèi)折好的吸水紙上，將已固定好樣品的載玻片放入雜交管中，然后在 46 ℃ 雜交爐中放置數(shù)分鐘。
（b）吸取 10 μL 探針貯存液和 80 μL 雜交緩沖液混合后，用箔紙包好放入 46 ℃ 雜交爐中預(yù)熱數(shù)分鐘；探針貯存液濃度為 25 ng/μL，用無菌水稀釋購買的探針，實驗用的探針序列及雜交條件見表 1-3 所示。
 
表 1-3 用于檢測樣品中 AOX、NOX 的寡核苷酸探針及雜交條件
 
探針              探針序列(5’～3’)            標(biāo)記細(xì)菌種屬              濃度a                
NSO1225              CGCCATTGTATTACGTGTGA             Ammonia oxidizing beta-proteobacteria          35               
Nsv443          CCGTGACCGTTTCGTTCCG        Nitroso-spira, -lobus, -vibrio             30               
Nmv              TCCTCAGAGACTACGCGG         Nitroso-coccus            35               
Ntspa662              GGAATTCCGCGCTCCTCT          Nitrospira             35               
NIT3              CCTGGCTCCATGCTCCG            Nitrobacter           40               
Ntcoc206              CGGTGCGAGCTTGCAAGC         Nitrococcus mobilis             10               
Ntspn693              TTCCCAATATCAACGCATT         Nitrospina gracilis        20               
 
注：
 
（a）表示雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度（%）
（c）吸取 9 μL 預(yù)熱后的探針稀釋液涂于載玻片待測樣品上，然后將載玻片迅速地移回雜交管中于 46 ℃ 下進(jìn)行雜交（黑暗中進(jìn)行），雜交時間為 2～3 h；
（d）雜交后的洗脫：打開恒溫水浴槽，加熱到 48 ℃，對雜交緩沖液、淋洗緩沖液進(jìn)行預(yù)熱。雜交盒中取出載玻片用雜交緩沖液沖洗樣品后，快速放入淋洗緩沖液，48 ℃ 水浴 20 min 后用 4 ℃ 冰水，沖洗樣品，樣品潔凈臺中揮干。
 
DAPI 染色
每孔滴 9 uL DAPI，4 ℃ 暗處 5 min，4 ℃ 冰水（BPS 緩沖溶液）沖洗，揮干。用帶有 360 nm 激發(fā)波長，460 nm 發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全細(xì)胞計數(shù)。
 
封片
涂封片劑，蓋蓋玻片，無氣泡后指甲油封裝。
 
熒光顯微鏡進(jìn)行檢測
每個樣品及每個探針都采集 20 個不同區(qū)域。每個區(qū)域中的細(xì)胞個數(shù)要超過 1000 個，然后進(jìn)行平均以獲得每個探針對于每個樣品的雜交結(jié)果。細(xì)菌豐度或細(xì)菌數(shù) 目（cells/g 或 cells/L）為 AS1/（S2V），其中 A 為視野中細(xì)菌平均數(shù)；S1 為樣品涂抹面積；S2 為視野涂抹面積；V 為樣品體積。